چکیده:
تیمول یکی از پرکاربردترین متابولیت ثانویه درگیاه آویشن (Thymus vulgaris L.) بعنوان دارو میباشد. یکی از ژن هایکلیدی که در سنتز آن نقش دارد ژن سیتوکرومp450 است. به منظور جداسازی و همسانه سازی آن ابتدا استخراج RNA انجام شد و پس از ساخت cDNA با استفاده از آغازگرهای طراحی شده از مناطق حفاظت شده در حضور آنزیم HF که خاصیت ′ 3 به ′5 اگزونوکلئازی دارد عمل تکثیر صورت گرفت. در مرحله اول، همسانه سازی به روش T/A کلونینگ در پلاسمید pTG19 صورت گرفت. انتخاب نوترکیبها از طریق سیستم PCR کلونی و هضم آنزیمی با BamHI انجام شد. قطعات همسانه شده برای تایید نهایی توالی یابی شدند. به منظور همسانه سازی در وکتور بیانی pBI121GUS-9 قطعه برش خورده با آنزیم BamHI در سایت همولوگ در وکتور pBI121GUS-9تحت پروموتر 35s و خاتمه دهنده Nos همسانه شد. تایید کلونیهای نوترکیب با PCR کلونی و هضم آنزیمی انجام شد. وکتور نوترکیب گیاهی طراحی شده میتواند جهت پژوهشهای بعدی به منظور فرا بیان تیمول مورد استفاده قرار گیرد.
Thymol is one of the most widely used secondary metabolites in Thymus vulgaris, as a drug. One of the
key genes which is involved in its synthesis is the cytochrome p450 gene. In order to isolate and cloning
p450 gene, the extraction of RNA was carried out subsequently the cDNA synthesized. Amplification of
cDNA was carried by using designed primers from conserve region in the presence of the HF enzyme that
has the property of 3′ to 5′ exonuclease. In first stage cloning was done by T/A method in plasmid pTG19.
Selection of recombinant colony was performed by PCR system and digestion with BamHI. The cloned
fragments were sequenced for the final confirmation. In order to cloning in the plant expression vector
pBI121GUS-9, the fragments that were cut with the BamHI enzyme were cloned in homologous site of the
pBI121GUS-9 vector under the promoter 35s and the Nos terminator. Confirmation of recombinant colonies
was performed with colony PCR and digestion. This designed recombinant vector can be used for further
research and over- expression of thymol.